北京協(xié)和醫(yī)院近期發(fā)布了《新型冠狀病毒核酸檢測(cè)》標(biāo)準(zhǔn)操作流程。這為我們建設(shè)2019-nCov新型冠狀病毒P3實(shí)驗(yàn)室建設(shè)提供了科學(xué)指導(dǎo)。
PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)備一站式采購(gòu) 152——2136——9228
具體檢測(cè)流程如下
一、核酸檢測(cè)前的生物安全防護(hù)（工作人員個(gè)人三級(jí)防護(hù)的穿戴）
1、穿戴流程：
在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的清潔區(qū)（更衣區(qū)）或者普通實(shí)驗(yàn)室的潔凈區(qū)，工作人員按順序依次穿戴好一次性帽子、醫(yī)用N95口罩、一次性防護(hù)服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防護(hù)目鏡和雙層乳膠手套，進(jìn)入樣本處理工作區(qū)域或?qū)嶒?yàn)室。
2、要點(diǎn)提示：
2.1、具備標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增布局條件的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)在清潔更衣區(qū)做好個(gè)人三級(jí)防護(hù)，條件有限的實(shí)驗(yàn)室亦可選擇在一潔凈的實(shí)驗(yàn)室中按流程穿戴好個(gè)人三級(jí)防護(hù)。
2.2、需佩戴醫(yī)用N95口罩，若無(wú)醫(yī)用N95口罩，可以考慮用普通N95/KN95口罩外加一次性外科口罩的組合方式，但不要佩戴有呼吸閥的N95口罩。
2.3、佩戴N95口罩時(shí)需檢查密閉性，通過(guò)雙手按壓、深呼吸、左右轉(zhuǎn)頭等動(dòng)作嚴(yán)格檢查口罩是否佩戴正確。
2.4、一次性防護(hù)服已具備新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的防護(hù)需求，有條件時(shí)可以考慮加穿一次性反穿隔離衣，穿衣時(shí)需由他人協(xié)助。
2.5、穿戴整齊的工作人員，應(yīng)按要求盡快進(jìn)入樣本處理的實(shí)驗(yàn)區(qū)域開展工作，嚴(yán)禁穿戴三級(jí)防護(hù)后再進(jìn)入普通實(shí)驗(yàn)區(qū)域或辦公區(qū)域。
二、樣本的滅活處理
1、操作流程：
兩名完成三級(jí)防護(hù)的工作人員，進(jìn)入樣本處理區(qū)或樣本處理實(shí)驗(yàn)室，將接收到的樣本二級(jí)包裝在安全柜內(nèi)打開，檢查樣本主容器是否為嚴(yán)格密閉；對(duì)密封袋表面進(jìn)行消毒后，對(duì)送檢樣本進(jìn)行56℃下30分鐘的滅活，滅活后的樣本管需在生物安全柜內(nèi)打開內(nèi)層的容器，將拭子保存液混勻后進(jìn)行分裝和用于核酸提取。
2、要點(diǎn)提示：
2.1、涉及高致病性病原微生物的實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)，需由兩名工作人員完成，其中一人負(fù)責(zé)主要實(shí)驗(yàn)操作，一人提供必要的協(xié)助。主操作者應(yīng)避免反復(fù)多次進(jìn)出安全柜。
2.2、滅活形式：可以采用水浴或空氣加熱形式完成滅活，采用空氣加熱時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)滅活時(shí)間。有條件時(shí)可以采用小型化設(shè)備在安全柜內(nèi)操作，減少樣本進(jìn)出安全柜的次數(shù)。滅活前的樣本嚴(yán)禁在生物安全柜外打開和操作。
2.3、應(yīng)特別檢查采樣管是否擰緊、有無(wú)樣本溢漏等情況。
2.4、樣本管每次進(jìn)出安全柜均需對(duì)外表面進(jìn)行消毒。
2.5、應(yīng)就近配備適量的消毒處理物品，以防止實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中可能發(fā)生的意外溢灑事故，有條件時(shí)建議在安全柜內(nèi)配備一次性吸水臺(tái)布。
三、樣本的核酸提取
1、手工核酸提取操作流程（以凱杰的52906柱提法核酸提取試劑盒為例）
1.1、裂解液配制：在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的試劑配制區(qū)或單獨(dú)的普通試劑配制實(shí)驗(yàn)室中，準(zhǔn)備核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分別向洗液1和洗液2中加入分子生物學(xué)級(jí)別的130ml和160ml的無(wú)水乙醇并及時(shí)做好標(biāo)記；取310μl洗脫液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通過(guò)傳遞窗進(jìn)入核酸提取區(qū)或由工作人員送入核酸提取實(shí)驗(yàn)室。
1.2、樣本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml無(wú)菌EP管中，加入5、6μl配制好的Carrier RNA，再加入已經(jīng)滅活的140μl樣本（例如咽拭子、血漿等），混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鐘，充分裂解樣本中的核酸。將EP管瞬時(shí)離心后加入560μl無(wú)水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時(shí)離心后備用。吸取630μl裂解產(chǎn)物，小心加入至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘，轉(zhuǎn)移離心柱至新收集管，將剩余630μl裂解產(chǎn)物加到離心柱中，重復(fù)上一離心操作（若樣本體積大于140μl，則在此步驟重復(fù)將630μl裂解產(chǎn)物過(guò)濾收集在一個(gè)離心柱上）。
1.3、核酸的洗滌：取500μl洗液1（AW1）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，用14000rpm（或20000g）離心3分鐘，去除洗液2（AW2）；換新收集管后，繼續(xù)用離心機(jī)大轉(zhuǎn)速（20000g）離心1分鐘，充分甩離殘留的洗液2（AW2）。
1.4、核酸的洗脫和回收：取一1、5ml無(wú)菌EP管，將離心柱放入其中，加入洗脫液（AVE）40~60μl，室溫靜置1分鐘后，用8000rpm離心1分鐘回收核酸，以備PCR檢測(cè)使用。
1.5、要點(diǎn)提示：
（1）、新鮮裂解液的配制應(yīng)盡可能在專門的潔凈區(qū)域或單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
?。?）、要用分子生物學(xué)級(jí)別的無(wú)水乙醇試劑進(jìn)行配制。
?。?）、向離心柱中加入裂解產(chǎn)物、洗液時(shí)操作要非常小心，盡量將洗頭下探到離心柱內(nèi)部后靠管壁加樣，切忌出現(xiàn)溢灑后污染到離心柱的密封圈，這可能會(huì)導(dǎo)致乙醇?xì)埩?，抑制后續(xù)PCR反應(yīng)。
?。?）、從離心機(jī)中取出離心柱時(shí)應(yīng)小心操作，避免離心柱下緣被收集管中的濾過(guò)殘液污染。
?。?）、加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速離心非常關(guān)鍵，能幫助充分甩離離心柱濾膜中殘留的洗液2殘液，確保洗脫核酸的純度。
（6）、洗脫液加樣時(shí)需小心操作，確保洗脫液盡可能覆蓋全部離心柱濾膜，充分洗脫核酸，提高核酸提取的產(chǎn)量。
?。?）、手工核酸提取可優(yōu)選使用檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書推薦的配套手工提取試劑，也可選用通用手工提取試劑。
?。?）、樣本處理過(guò)程中，工作人員覺得有必要時(shí)，應(yīng)隨時(shí)更換新的外層乳膠手套。
2、采用核酸提取儀提取核酸的操作流程
根據(jù)核酸提取儀和試劑的說(shuō)明書準(zhǔn)備好提取試劑，取200μl樣本上機(jī)提取核酸，并按照要求回收提取好的核酸備用。
要點(diǎn)提示：
1、不同的提取儀器和試劑的提取效率可能存在差異，請(qǐng)一定嚴(yán)格按照提取試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行核酸提取操作。
2、有條件時(shí)可以考慮配備小型化的核酸提取儀在安全柜內(nèi)使用，以進(jìn)一步加強(qiáng)生物安全防護(hù)；若使用在安全柜外的核酸提取儀，則一定要做好生物安全防護(hù)及樣本的防污染保護(hù)。
四、PCR體系的配制和模板加樣
1、操作流程：
在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的試劑配制區(qū)或單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室，配制PCR體系。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的要求，將試劑盒的不同組分（一般包括反應(yīng)液、酶、引物等）按照各自必須的體積量進(jìn)行配制混合，充分混勻并離心后，通過(guò)傳遞窗傳遞到核酸提取和加樣區(qū)，或由專人從試劑配制實(shí)驗(yàn)室送至核酸提取和加樣實(shí)驗(yàn)室。在加樣生物安全柜內(nèi)，根據(jù)檢測(cè)樣本例數(shù)分裝體系到每個(gè)反應(yīng)管中，逐一將樣本核酸加入到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管中，并加蓋密閉好PCR反應(yīng)管；每批次檢測(cè)需要做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。
2、要點(diǎn)提示：
?。?）、試劑配制必須嚴(yán)格在試劑配制區(qū)或單獨(dú)、潔凈的實(shí)驗(yàn)室和安全柜內(nèi)進(jìn)行，以確保試劑不會(huì)有被污染的可能。
（2）、試劑配制時(shí)要根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)量進(jìn)行合理配制，每批次檢測(cè)均需要包括3個(gè)陰性對(duì)照和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的試劑，同時(shí)還需要考慮試劑分配過(guò)程中的正常損耗等消耗。
?。?）、加樣可以和樣本處理/核酸提取在同一分區(qū)或同一間實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但如有條件好在單獨(dú)的加樣區(qū)或至少使用安全柜進(jìn)行加樣。
（4）、體系分裝建議每次更換新的吸頭，避免反復(fù)使用帶來(lái)體積誤差和交叉污染。
（5）、應(yīng)配置體系加樣登記表，確保加樣過(guò)程準(zhǔn)確無(wú)誤。
?。?）、PCR密閉管蓋應(yīng)特別謹(jǐn)慎，建議更換新的手套，防止手套等接觸管蓋內(nèi)部帶入污染的風(fēng)險(xiǎn)。
五、上機(jī)檢測(cè)及結(jié)果分析
1、操作流程：
在擴(kuò)增區(qū)或擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室，由專人取出配制好的PCR檢測(cè)管，混勻、離心后，小心上機(jī)檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)并分析判讀結(jié)果。進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，應(yīng)認(rèn)真閱讀試劑盒說(shuō)明書，在了解該試劑盒的靈敏度、檢測(cè)方法和局限性等技術(shù)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合該批次陰性質(zhì)控的結(jié)果，綜合判讀樣本的檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)束后，為防止可能的擴(kuò)增污染，擴(kuò)增結(jié)束后的PCR管嚴(yán)禁開蓋或帶離擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)盡快通過(guò)可密封塑料袋等容器盛裝密閉后，放入醫(yī)療垃圾桶中做進(jìn)一步處理。
2、要點(diǎn)提示：
?。?）、因基因擴(kuò)增區(qū)存在污染的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)設(shè)專門的擴(kuò)增區(qū)域或在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增，必須和核酸提取、試劑配制區(qū)域有嚴(yán)格的物理分割。
（2）、不同操作區(qū)域的工作服不要混穿，特別是基因擴(kuò)增區(qū)的工作服，建議僅在擴(kuò)增區(qū)域或擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。
?。?）、熟悉檢測(cè)用PCR儀器的基本性能和特點(diǎn)，能客觀分析判斷檢測(cè)結(jié)果。
六、檢測(cè)后的消毒處理
1、操作流程：
?。?）、生物安全柜內(nèi)：在完成樣本核酸提取后，應(yīng)在安全柜內(nèi)用75%消毒酒精對(duì)外層手套進(jìn)行消毒處理，并將外層手套取下后棄至安全柜內(nèi)的垃圾桶中。小心收納并丟棄使用過(guò)的一次性吸水臺(tái)布，用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精擦拭安全柜臺(tái)面、移液器等安全柜內(nèi)全部?jī)x器的表面。將安全柜內(nèi)產(chǎn)生的新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療垃圾經(jīng)3層包裝后，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)療垃圾桶中。開啟紫外燈照射生物安全柜，時(shí)間應(yīng)大于30分鐘。
（2）、樣本核酸提取工作人員實(shí)驗(yàn)室內(nèi)：他人協(xié)助用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精均勻噴灑內(nèi)層手套、袖口、手臂及隔離衣后，將外層反穿隔離衣脫下至新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾桶中送高壓處理。
?。?）、樣本處理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)：用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精消毒實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面和地面；開紫外燈進(jìn)行大于30分鐘的空間消毒。
（4）、工作人員摘脫三級(jí)防護(hù)：在緩沖區(qū)戴新的外層手套，摘護(hù)目鏡置于75%酒精浸泡消毒，從頭開始，自上而下、由內(nèi)而外緩慢翻轉(zhuǎn)脫下一次性防護(hù)服，直到將一次性防水靴套全部脫下，將防護(hù)服置于新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾桶中送高壓處理。摘口罩、帽子、內(nèi)層鞋套和內(nèi)層手套后同樣置于新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾桶中送高壓處理。
?。?）、新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療垃圾：所有新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療垃圾均需經(jīng)濕熱高壓滅菌后再作為普通醫(yī)療垃圾處理，且垃圾袋上應(yīng)標(biāo)注新型冠狀病毒醫(yī)療垃圾的相關(guān)信息。高壓處理前后的垃圾要嚴(yán)格區(qū)分，在高壓滅菌區(qū)域?qū)π滦凸跔畈《踞t(yī)療垃圾進(jìn)行濕熱高壓滅菌處理，高壓參數(shù)為121℃、30分鐘。高壓要做物理、生物指示，以確保高壓滅菌的效果。
2、要點(diǎn)提示：
?。?）、生物安全柜內(nèi)是風(fēng)險(xiǎn)高區(qū)域，操作者的外層手套經(jīng)消毒后必須脫在安全柜內(nèi)。
?。?）、靴套或鞋套的主要作用是對(duì)操作者的腳和腿部進(jìn)行防護(hù)，要求必須防水，以確保在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)生意外遺灑時(shí)可隔離污染。
?。?）、核酸提取儀內(nèi)部、生物安全柜內(nèi)部和實(shí)驗(yàn)室空間均應(yīng)進(jìn)行紫外線消毒，但紫外線對(duì)空氣的消毒效果好，對(duì)物體表面的消毒效果隨距離變遠(yuǎn)而減弱，故在紫外線消毒前，仍需對(duì)各種儀器表面、臺(tái)面、地面用消毒劑進(jìn)行擦拭消毒。
?。?）、工作人員在摘脫個(gè)人三級(jí)防護(hù)后，仍應(yīng)參照實(shí)驗(yàn)室原有實(shí)驗(yàn)后操作流程進(jìn)行嚴(yán)格認(rèn)真的常規(guī)消毒處理，特別是實(shí)驗(yàn)后的手衛(wèi)生環(huán)節(jié)。
PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 152——2136——9228
